2.3 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS

El establecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro es una técnica de la Biotecnología que comprende al conjunto de técnicas que permiten la manipulación biológica de células u órganos vivos, con fines de mejoramiento genético, desarrollo de productos medicinales, investigación científica entre otros.

Se afirma que la técnica de cultivo de tejidos vegetales se originó en el siglo pasado con el reporte del cultivo indefinido de tejidos vegetales de zanahoria (Daucus carota L.) y tabaco (Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii L.) ambos se lograron simultáneamente, por primera vez, en 1939 en Francia por Gautheret y Nobecourt y en Una plántula del árbol de hule (Hevea brasiliensis Müll.) desarrollándose en un cultivo in vitro. (Foto CIRAD Francia) EE UU por White. 

2.3.1ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

Según T.Murashigue (1962)  Existen 5 fases o etapas del cultivo de tejidos vegetales, las cuales son:

Fase 0: SELECCIÓN DE PLANTAS

En esta etapa se selecciona adecuadamente las plantas que serán donadoras de explantes.

FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA

Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. 

Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.

Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantes del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo.

FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Los nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.

FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:

ENRAIZAMIENTO IN VITRO

Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar y como la fuente de energía para enraizar está en el medio de cultivo no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

ENRAIZAMIENTO EX VITRO

Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita. Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.

Los explantes deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos  dentro de un invernadero en un área sombreada.

FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Tanto si los explantes fueron enraizados in vitro como ex vitro, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para para evitar la desecación del explante. Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula cérea bien desarrollada.

 Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.