CONCLUSIÓN FINAL DE LA UNIDAD NUMERO 2

Como conclusión final, puedo decir y afirmar que se cumplió con todos los temas mencionados en el temario, se cumplió con el objetivo de poder aprender todos esos puntos. Aprendimos de forma generalizada que es un medio de cultivo, y la técnica de medio de cultivo

En esta unidad también conocimos y aprendimos principalmente las áreas con las que cuenta un laboratorio de cultivos vegetales y el material y equipo que se encuentren dentro de él. Partiendo de ahí, conocimos y lo pusimos en práctica en el laboratorio todo lo relacionado con la técnica de cultivo de tejidos vegetales, sus generalidades principales, sus componentes, aprendimos a prepararlos, y repasamos el tipo de esterilización que se usa en esta técnica y los demás tipos de esterilización existentes así como los factores que influyen en ella, en la práctica de siembra aprendimos a como sembrar un explante, que condiciones necesita para que este crezca adecuadamente, las condiciones de incubación que esta presenta, y los cambios fisiológicos que desarrolla.

De los inconvenientes que tuve en esta unidad, fue un poco en cómo hacer los cálculos para preparar los medios de cultivo, puesto que se me dificulta un poco trabajar con número y demás  Pero es cuestión de practicar para aprender a realizaros de una mejor manera.

A manera futura esta unidad me va a servir para las demás unidades que siguen, pues van relacionadas y así mismo voy a poder relacionar conceptos nuevos con los anteriores. 

2.3.7 TRASPLANTE AL SUSTRATO

Las plántulas recién enraizadas son sensibles a los cambios ambientales y esto va a depender del éxito o el fracaso. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.

En el momento en que se extraen los explantes enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante.

Crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta.

De acuerdo a los apuntes realizados en clase, cabe mencionar que el trasplante de una plántula in vitro a campo debe ser mediante aclimatación, mediante el cual este proceso dura regularmente entre 4 y 8 semanas consistiendo en el endurecimiento y sobre todo en la adaptación de la plántula al campo, lo cual debe ser paulatinamente y secuencialmente. 

Los pasos son los siguientes:

2.3.6.- CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE

Algunos de los cambios fisiológicos que presentan los explantes son los siguientes:

§  Estomas atrofiados, no son funcionales al 100%.

§  Cutícula más delgada y con aberturas.

§  Parénquima desorganizado, no están unidas, es decir, es ineficiente.

§  Con menos luz y azúcar en las plantas se realiza menos fotosíntesis y en gran porcentaje son heterótrofas y en poco porcentaje son autótrofas.

§  Como tienen mucha humedad relativa las raíces son más delgadas, pocas raíces y no son funcionales.

§  No realiza fotosíntesis.

§  Crecimiento en condiciones controladas.

§  Crecimiento en condiciones de asepsia.

§  Estomas no funcionales ya que no cierran y por lo tanto el agua se escapa.

§  Ausencia de pelos radiculares tienen raíces delgadas que solamente son funcionales en el frasco.

§  Ausencia de cera en la cutícula.

2.3.5 CONDICIONES DE INCUBACIÓN

Las condiciones de incubación para el establecimiento de un cultivo de tejidos vegetales deben ser estrictas, esto para que la planta pueda desarrollarse y crecer exitosamente, aprovechando la gama de nutrientes que se encuentran en el medio donde esta se estableció. 
Las condiciones afectan directamente tanto a los cambios fisiológicos del explante como al trasplante de plantas in vitro al sustrato.
Entre esas condiciones las más importantes son:

2.3.4 SIEMBRA DEL EXPLANTE

Después de esterilizar los medios MS y los materiales que se utilizaran se procede a la siembra de explantes en la cámara de flujo laminar, la cual se desinfecta con anterioridad para evitar contaminación del medio.

Se lavan  bien las manos con agua y con jabón para después desinfectar con alcohol de 96° y  se meten en la cámara de flujo laminar mientras alguien más corta los explantes para después llevarlos a la cámara de flujo laminar en un frasco, al que se le coloca la mitad de agua destilada y la otra mitad de cloralex, esto para desinfectar a los explantes se dejan desinfectando durante 5 min, después se hacen dos lavados  el primero de un minuto y el segundo de 5 minutos. Se coloca el mechero de alcohol encendido en la cámara de flujo laminar, en un frasco vacío estéril se colocan las pinzas y el bisturí  los cuales se estarán desinfectando cada vez que se ocupen, la desinfección se realiza remojando el material (pinzas y bisturí) en alcohol de 70° y después exponerlo al fuego directo y se coloca en el frasco vació para continuar con la siembra.

Para la siembra se corta la orilla inferior del explante ya que con el cloralex se quema y muere una pequeña porción del explante, se toma con las pinzas desinfectadas para depositarlo en el frasco con el medio MS este frasco se destapa y se mantiene la tapadera entre los dedos al igual que el frasco sin tocar el interior de ambos, sin meter los dedos en el interior del frasco se coloca el explante sobre el medio de cultivo tratando de que este quede poco sumergido y con la punta hacia arriba.

Una vez terminada la siembra se tapan y sellan los frascos para ser llevados al área de crecimiento. 

2.3.2 SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES

La selección de las plantas madres depende de varios factores:

Edad: Entre más jóvenes sean, son mejores.

Posición de la planta: Los explantes deben ser ubicados en la parte superior tercio medio y superior.

Estado fenológico de la planta: El estado vegetativo es el más adecuado

Sanidad y Nutrición: Las plantas deben estar sanas y deben de ser vigorosas.

Tipo herbácea y leñosa: Las plantas herbáceas son las mejores, las plantas leñosas necesitan medios especiales. 

2.3.3 EXPLANTE

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas. El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo.

Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo. 

2.3 ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS

El establecimiento de cultivos de tejidos vegetales in vitro es una técnica de la Biotecnología que comprende al conjunto de técnicas que permiten la manipulación biológica de células u órganos vivos, con fines de mejoramiento genético, desarrollo de productos medicinales, investigación científica entre otros.

Se afirma que la técnica de cultivo de tejidos vegetales se originó en el siglo pasado con el reporte del cultivo indefinido de tejidos vegetales de zanahoria (Daucus carota L.) y tabaco (Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii L.) ambos se lograron simultáneamente, por primera vez, en 1939 en Francia por Gautheret y Nobecourt y en Una plántula del árbol de hule (Hevea brasiliensis Müll.) desarrollándose en un cultivo in vitro. (Foto CIRAD Francia) EE UU por White. 

2.3.1ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

Según T.Murashigue (1962)  Existen 5 fases o etapas del cultivo de tejidos vegetales, las cuales son:

Fase 0: SELECCIÓN DE PLANTAS

En esta etapa se selecciona adecuadamente las plantas que serán donadoras de explantes.

FASE I: ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO EN CONDICIONES DE ASEPSIA

Una vez escogida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. 

Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia.

Ya en condiciones de asepsia (se trabajará en cabinas de flujo laminar) se extraerán los explantes del material vegetal y se pondrán en cultivo en un medio de iniciación dentro de un tubo de cultivo.

FASE II: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Los nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar.

FASE III: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente dos métodos:

ENRAIZAMIENTO IN VITRO

Se transfieren los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga auxinas. Esta operación se realiza en la cámara de flujo laminar y como la fuente de energía para enraizar está en el medio de cultivo no es necesario que tengan las hojas muy bien desarrolladas para realizar la fotosíntesis.

ENRAIZAMIENTO EX VITRO

Los explantes se deben transferir a un sustrato limpio, aunque no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita. Con este método es necesario que el medio de enraizamiento esté libre de organismos patógenos y que los brotes tengan las hojas bien desarrolladas, ya que deben realizar fotosíntesis para que la planta tenga una fuente de energía para enraizar y desarrollarse.

Los explantes deben de plantarse en contenedores cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada, y hacerlos enraizar en el laboratorio, o ponerlos  dentro de un invernadero en un área sombreada.

FASE IV: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Tanto si los explantes fueron enraizados in vitro como ex vitro, están poco adaptados a crecer en un invernadero, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas perezosos para responder al descenso de la humedad relativa, demasiado lentos para para evitar la desecación del explante. Por otra parte crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula cérea bien desarrollada.

 Los explantes deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz.

2.2.2 FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACIÓN

FISICOS

Fuego directo: Mechero, colocando azas o pinzas. Funciona para cultivos de tejidos vegetales

Agua hervida: No es muy usada

Bacto-incinerador

Luz ultravioleta: Destruye cadenas de ADN de los microorganismos, antes de trabajar. 380- 220 nm

Muflas- (estufas): Calor seco de 190°C a 2hras. Se esteriliza, se colocan instrumentos como cajas de petri, pinzas, etc. (se toma en cuenta el TIEMPO Y LA TEMPERATURA)

Filtración: Se colocan una serie de filtros con poros pequeños que filtran bacterias o microorganismos, esto para compuestos termolábiles (A.I.A o AA)

Calor húmedo: Se utiliza una olla de presión, se toma en cuenta: la presión 1.2 Kg/cm2  -- 15(PSI), tiempo 20 min., temperatura 121° C.

QUIMICOS

NaClO (hipoclorito de sodio): Utilizado a 20min. Durante 1hra al 20%, sustancia a utilizar

CaClO (hipoclorito de calcio)

Oxido de etileno

Ozono

HgCl2(bicloruro de mercurio): Es la mejor sustancia a utilizar

H2O2(peroxido)

Nitrato de plata

Yodex: Sustancia a utilizar

Aldehido

Fenol

Alcohol (etanol): Sustancia a utilizar 

2.2 ESTERILIZACIÓN

Por su diminuto tamaño, los microorganismos no pueden estudiarse como individuos, sino que es necesario manejarlos como poblaciones. Para ello es necesario cultivarlos, es decir, favorecer su multiplicación in Vitro, en ambientes especiales que proporcionen las condiciones semejantes a las de sus hábitats naturales. En estos ambientes se debe eliminar a todos aquello microorganismos que interfieren en el estudio del microorganismo de interés, al que además de proporcionar los nutrientes necesarios para su crecimiento multiplicación.

La esterilización es un proceso a través del que se puede lograr la destrucción total de los microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización de materiales estériles. Entre éstos podemos destacar:

La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes.

El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiología.

La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.)

2.2.1 TIPOS DE ESTERILIZACIÓN

Agentes físicos

		Ventajas	Desventajas
Calor húmedo	Produce desnaturalización de las proteínas.	·Rápido calentamiento y penetración ·Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo ·No deja residuos tóxicos ·Hay un bajo deterioro del material expuesto ·Económico	·No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua ·Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.
Calor seco	Produce la desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles de electrolitos, procesos oxidativos  y fusión de membranas.	·No es corrosivo para metales e instrumentos ·Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles	·Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.
Radiación	La radiación, o emisión y propagación de la energía a través de un medio, puede  ser utilizada como agente para la eliminación de microorganismos. Así tenemos  que las radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilización de materiales termolábiles, como por ejemplo materiales plásticos, y las radiaciones no ionizantes.

 Agentes mecánicos

Filtración 

La filtración permite la remoción de todos los microorganismos presentes en un líquido o un gas reteniéndolos sobre la superficie de un material.

Agentes químicos

Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o más reacciones químicas capaces de dañar los componentes celulares de los microorganismos (proteínas, membranas, etc).

Dentro de los compuestos químicos podemos encontrar agentes esterilizantes, desinfectantes y antisépticos.

Antisépticos	Alcoholes
	Iodo
	Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros
	Órgano Mercuriales
	Colorantes
Desinfectantes y/o Esterilizantes	Cloro y Compuestos clorados
	Aldehídos
	Óxido de Etileno
	Compuestos Fenólicos
	Ácidos y Alcalis

2.1.5 PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La preparación adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos en el laboratorio.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: 
• Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.
• Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.
• Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
• Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante. 

Ejemplo: Preparar 500 mL De Un Medio MS (1x), partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100x, añadiendo 30g / L de sacarosa y 2.8g / L de Phytagel.

Fórmula para utilizar ciertos ml de la solución de 50x y verterlo para hacer 500 ml.:

Datos		Sustitución
V1	500 ml	V2: V1 C1/C2; V2: 500 ml x 1x / 50x= 10 ml de solución stock
C1	1x
V2	¿
C2	50x
Phytagel	2.8 g/L	2.8 g/L x 500 ml / 1000 ml= 1.4 g/500 ml
Sacarosa	30 g/L	30 g/L x 500 ml / 1000 ml= 15 g/500 ml

Después de haber obtenido los cálculos de las concentraciones, se toman estos pasos:
en un vaso de precipitado se colocan 100 mL de agua, colocarle la cantidad de las 6 soluciones y sacarosa (azúcar), se afora a 500 mL en la probeta, después se agregan las hormonas A.N.A. y B.A.P., se mide el pH que quede entre 5.6 y 5.8 y por último se agrega el Phytagel poco a poco, se calienta a 40° c , ya que empiece a hervir (formarse burbujas) se toma el tiempo de 1 a 2 minutos, por último se deja enfriar para después servirlos en los frascos de 20 ml.

2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

Son varios los componentes que un medio de cultivo necesita para que se desarrolle en perfectas condiciones, entre estos componentes encontramos:

Compuestos inorgánicos:

Macronutrientes: NO₃^- , PO₄^3- , K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, SO₄^2-

Micronutrientes: Fe²⁺, Cu²⁺, Zn⁺, Mn²⁺, Mo²⁺, Co²⁺, I^-

Carbohidratos:

Sacarosa, glucosa, mio-inositol

Vitaminas:

Tiamina (B1)

Piridoxina

Acido nicotínico (C)

Biotina

Aminoácidos:

Glicina

Reguladores del crecimiento:

Auxinas

Citocininas

Giberelinas

Soporte inerte:

(medios semisólidos)

Agar (0,7 a 1%)

Gelrite^®

pH:

5,6 – 5,8

Esterilización:

1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

AGUA DESTILADA

2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo se puede determinar, como solución o formulación químicamente definida, donde un explante encuentra las condiciones adecuadas para desarrollar su potencial intrínseco. Las células vegetales requieren gran variedad de nutrimientos orgánicos e inorgánicos, para desarrollarse, ambos nutrimentos se requieren en dos niveles: uno macro y otro micro. El primer objetivo en la preparación de un medio de cultivo es suministrar los nutrimentos minerales en concentraciones adecuadas. Se debe incluir macro elementos ( C, H, O, P, K, N, S, Ca Y Mg ) y los microelementos ( B, Zn, Mn, Cu, Mo, Fe, Cl ).

Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo “in vitro” de células, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones y lograr la micropropagación, etc. Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y específicos cuya presencia y concentración estará en dependencia del objetivo que se persiga en su utilización. Así, los medios de cultivo pueden ser líquidos o tener un soporte sólido, tienen sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, fitohormonas, etc. 

2.1.1 ÁREAS DEL LABORATORIO DE CULTIVOS DE TEJIDO

2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

La micropropagación vegetal requiere disponer de una infraestructura   mínima especializada y de condiciones controladas de cultivo. Para ellos se encuentran diferentes áreas de laboratorio y en cada una de ellas encontramos material y equipo específicos para cada área. 

1. ÁREA DE OFICINA

Material	Equipo
Escritorio	Computadoras
Sillas	Equipo de calculo
Mesas	Equipos de primeros auxilios
Archivos documentados	Extintores de incendio
Libros de referencia	Cañón
Pizarrón

2. ÁREA DE PREPARACIÓN DE MEDIOS

Material	Equipo
Balanzas	Refrigerador
Frascos Erlenmeyer	Pancha eléctrica
Matraces	Potenciómetro
Vasos de precipitados	Tubos conductores de gas y agua
Probetas	Parrillas
Macrobalanza	Microbalanzas
Pipetas

3. ÁREA DE LAVADO Y ESTERILIZACIÓN

Material	Equipo
Recipientes de plásticos grandes	Autoclave
Gradillas	Destilador de Vidrio
Bandejas de aluminio	Estufas para esterilización
Bandejas de plástico de varios tamaños	Estufas para secado
Recipientes de plásticos	Lavadero grande con agua fría y caliente
Basureros	Secadores
Olla de presión

4. ÁREA DE SIEMBRA O TRANSFERENCIA

Material	Equipo
Mechero de alcohol	Gabinetes de flujo laminar
Cuchillas	Microscopio de disección
Mangos para cuchillas	Cámara de siembra
Agujas de disección	Estante
Pinzas	Carro de laboratorio
Tijeras
Guantes

5. ÁREA DE INCUBACIÓN

Material	Equipo
Termómetros	Estantes
Bandejas	Aire acondicionado
Gradillas	Cuarto con temperatura, iluminación y humedad relativa.
Tubos de ensayo	Termostato

6. ÁREA DE OBSERVACIÓN Y EXAMEN

Material	Equipo
Microscopio estereoscópico	Fuente de electricidad
Microscopio compuesto	Fuentes de energía de emergencia
Lentes de aumento	Fuente de aire
Porta y cubre objetos

7.ÁREA DE CRECIMIENTO

Material	Equipo
Macetas	Cámaras de alta humedad
Suelos	Centrifugas de mesas
Bandejas	Sistemas de filtración
Filtros	Gabinete
Frascos de vidrio	Lavadora de pipetas

8. ÁREA DE CUARENTENA Y DE CONTROL FITOSANITARIO

Material	Equipo
Material vegetal	Área para la recepción  de las muestras o plantas destinadas a la limpieza clonal